Densità della fibra nervosa epidermica - Range di riferimento ed efficienza diagnostica

December 1998

Justin C. McArthur, MBBS, MPH; E. Adelaine Stocks, MS; Peter Hauer, BS; et al

From the Departments of Neurology (Drs McArthur, Cornblath, and Griffin, Ms Stocks, and Mr Hauer) and Neuroscience (Dr Griffin), The Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, Md.

Arch Neurol. 1998;55(12):1513-1520. doi:10.1001/archneur.55.12.1513

https://jamanetwork.com/journals/jamaneurology/fullarticle/774528

Background La sensibilità degli anticorpi specifici dei neuroni consente l'identificazione delle piccole fibre nervose non mielinizzate all'interno della pelle. Obiettivi Sviluppare un range di riferimento della densità delle fibre nervose dell'epidermide nell'uomo e valutare la loro efficacia diagnostica per le neuropatie sensoriali. Metodi Sono stati esaminati novantotto controlli normali (fascia di età, 13-82 anni) con esami neurologici diretti e test sensoriali quantitativi. L'utilità diagnostica è stata esaminata in 20 pazienti con neuropatie sensoriali. Ogni soggetto aveva 2 biopsie perforate eseguite su ciascun sito nella coscia e nella parte distale della gamba (in totale 392 biopsie). Dopo la fissazione con formalina, sezioni libere flottanti di 50 μm sono state colorate con un anticorpo policlonale per l'ubiquitina idrolasi, prodotto del gene anti-proteina 9.5. Abbiamo elencato le fibre nervose intraepidermiche per millimetro per ricavare una "densità lineare". La tecnica della densità lineare è stata convalidata rispetto a una tecnica stereologica che utilizzava il frazionatore per misurare la lunghezza totale delle fibre nervose intraepidermiche per punch da 3 mm.

Risultati La tecnica di biopsia è stata ben tollerata, senza complicanze rilevanti. La quantificazione della densità lineare era rapida e aveva un'elevata affidabilità intraosservatore e interosservatore. Abbiamo determinato che la densità delle fibre intraepidermiche nei controlli normali era di 21,1 ± 10,4 per millimetro (media ± DS) nella coscia (quinto percentile, 5,2 per millimetro), ed era di 13,8 ± 6,7 per millimetro nella parte distale della gamba (quinto percentile, 3,8 per millimetro). Densità di fibre intraepidermiche significativamente più elevate sono state osservate nel gruppo più giovane (P = 0,004) e non abbiamo osservato alcun effetto significativo di razza, sesso, altezza o peso. La densità alla coscia era significativamente correlata con quella alla parte distale della gamba (P = .01) ed era costantemente più alta di circa il 60%, un riflesso del normale gradiente prossimale-distale. I risultati ottenuti con la stereologia e la densità lineare erano significativamente correlati (P ​​= .001), fornendo una convalida interna per la tecnica. La densità delle fibre del nervo epidermico era significativamente ridotta (P = 0,001) nei pazienti con neuropatie sensoriali. Con un cutoff derivato dal quinto percentile dell'intervallo normativo per la parte distale della gamba, la tecnica aveva un valore predittivo positivo del 75%, un valore predittivo negativo del 90% e un'efficienza diagnostica dell'88%. Conclusioni Abbiamo stabilito un intervallo di riferimento per la densità intraepidermica delle fibre nervose negli esseri umani normali mediante un semplice metodo di quantificazione basato sulla conta delle singole fibre nervose intraepidermiche su sezioni verticali di campioni di biopsia cutanea punch colorati con il gene sensibile marcatore panaxonale del prodotto anti-proteina 9.5 . L'utilità della misurazione della densità è stata confermata per la neuropatia sensoriale con un'efficienza diagnostica dell'88%. Le biopsie cutanee possono essere utili per valutare la distribuzione spaziale del coinvolgimento nella malattia del nervo periferico e la risposta alle terapie neurotrofiche e altre terapie protesiche. NEUROPATIA SENSORIALE è una condizione neurologica relativamente comune che può complicare, tra le altre patologie, il diabete mellito, l'infezione da virus dell'immunodeficienza umana e la chemioterapia del cancro, oppure può verificarsi spontaneamente. La frequenza della neuropatia nel diabete mellito è del 66%, 1 e nell'infezione da virus dell'immunodeficienza umana, l'incidenza annuale di neuropatia sensoriale è del 7% .2 Le fibre C e C di piccolo calibro che innervano la pelle sono coinvolte in molti di questi sensori neuropatie. Le malattie di queste fibre possono contribuire al dolore neuropatico o alla perdita della sensazione protettiva, con lesioni indolori. Attualmente sono disponibili poche misure oggettive per la valutazione delle fibre sensoriali di piccolo calibro. I limiti dei nostri attuali mezzi di valutazione di queste fibre sono stati un impedimento agli studi del decorso naturale e alle risposte terapeutiche nelle neuropatie sensoriali o nella componente sensoriale delle polineuropati sensomotorie. Man mano che aumenta il numero di potenziali terapie, in particolare i fattori neurotrofici destinati a specifiche classi di fibre, sarà necessaria anche una migliore tecnica per la valutazione strutturale pratica delle varie classi di fibre.

L'innervazione cutanea è stata tradizionalmente considerata come costituita da un plesso di fibre nel derma reticolare e da un plesso più superficiale nel derma papillare, con la maggior parte delle terminazioni sensoriali situate nel derma subpapillare. I terminali del nervo intraepidermico sono stati identificati negli strati basali dell'epidermide associati alle cellule di Merkel, 3 con i recettori del freddo, 4 e con i meccanorecettori ad alta soglia.5 Langerhans6 ha descritto per prima la penetrazione più profonda dei nervi intraepidermici, ma queste fibre si sono rivelate difficili da visualizzare, e la penetrazione oltre gli strati basali era considerata rara. Ad esempio, Ridley7 ha identificato solo i nervi intraepidermici "sparsi" in una minoranza di adulti e altri ricercatori hanno descritto terminazioni sensoriali all'interno dell'epidermide basale.8,9 In contrasto con queste osservazioni, Kruger et al.10 hanno usato la microscopia elettronica e la colorazione della sostanza P per dimostrare la profonda penetrazione degli assoni sensoriali nello strato di spinosum dell'epidermide. Diversi studi precedenti hanno valutato le fibre nervose cutanee in individui normali e in pazienti con neuropatia. Dyck e coworkers11 hanno usato le coloranti colinesterasi e Ridley7,12 ha usato macchie d'argento per indagare sui corpuscoli di Meissner. Questi ricercatori hanno dimostrato un declino ripido, legato all'età, nella densità dei corpuscoli di Meissner. Tuttavia, in questi e altri studi sui corpuscoli di Meissner, la variabilità tra i soggetti e tra i siti era elevata. Inoltre, poiché questi organi sensoriali terminali si trovano solo nella pelle glabra (come il dito o le dita dei piedi), la distribuzione spaziale del coinvolgimento non può essere valutata. Il recente avvento del prodotto del gene anti-proteina marcatore panaxonal 9.5 (PGP9.5) ha permesso il riconoscimento delle fibre intraepidermiche mediante colorazione immunocitochimica.6,12- 14 Queste fibre intraepidermiche hanno origine da nervi sensoriali mentre esprimono la sostanza P e il gene della calcitonina peptide correlato.15-17. Kennedy et al18,19 hanno utilizzato la microscopia PGP9.5 e confocale per quantificare i cambiamenti nell'innervazione delle ghiandole epidermiche e del sudore e recentemente hanno mostrato una relazione tra la gravità clinica della neuropatia periferica e la densità dell'innervazione epidermica. Questo marcatore offre un nuovo approccio per identificare e quantificare i nervi intraepidermici non mielinizzati, una classe di fibre frequentemente colpita da neuropatie sensoriali e sensomotorie dipendenti dalla lunghezza. Descriviamo un intervallo di riferimento per la densità delle fibre nervose intraepidermiche nella pelle umana in controlli sani e ben caratterizzati e determiniamo l'utilità diagnostica per la classificazione dei casi di neuropatia sensoriale.

Materie e metodi

controlli Sono stati reclutati novantotto controlli per la biopsia. Erano composti da impiegati universitari e ospedalieri, volontari per studi di farmacologia clinica e reclute da un gruppo ecclesiastico. I controlli sono stati pagati $ 100 per la loro partecipazione. Il protocollo è stato approvato dal nostro comitato di revisione istituzionale e il consenso informato è stato ottenuto prima di tutte le biopsie. L'intervista di screening iniziale è stata condotta per telefono e ha incluso una revisione dello stato di salute attuale e passato, concentrandosi su condizioni potenzialmente neuropatiche: diabete mellito, chemioterapia oncologica, precedenti neuropatie acquisite o ereditarie e forte abuso di alcool o esposizione a solventi. Le risposte positive in questa fase sono state una causa di esclusione. Il secondo stadio prevedeva un esame neurologico diretto da parte di un neurologo (J.C.M.) per escludere la neuropatia periferica e altre condizioni neurologiche confondenti, come la demenza, la cachessia, la malattia del midollo spinale e i segni di traumi locali negli arti. Nell'intervista sono stati inclusi due questionari: una breve scala di valutazione della neuropatia a 6 elementi (la scala di neuropatia soggettiva del gruppo di studi clinici sull'AIDS) e il profilo dei sintomi di neuropatia.20 I test sensoriali quantitativi sono stati completati mediante il dispositivo di valutazione sensoriale computerizzato (CASE) IV; WR Medical Electronics, Stillwater, Minn) 21 con un algoritmo di raffreddamento e vibrazione. Le caratteristiche demografiche (per decadi di età) dei 98 controlli neurologicamente normali sono mostrate nella TABELLA1

Pazienti con neuropatia Un gruppo di 20 pazienti con neuropatia sensoriale o sensomotoria è stato incluso per valutare l'utilità diagnostica della tecnica di quantificazione. Questi pazienti sono stati descritti in maggior dettaglio da Holland et al.22 Sono stati studiati tre gruppi: (1) 8 pazienti sieropositivi per virus dell'immunodeficienza umana (età compresa tra 38 e 57 anni), nei quali la neuropatia si è sviluppata durante il trattamento con gli agenti antiretrovirali didanosina o zalcitabina, e tutti avevano un'infezione sintomatica da virus dell'immunodeficienza umana o avevano avuto una malattia che definiva la sindrome da immunodeficienza acquisita, con un numero medio di cellule CD4 + di 0,03 × 109 / L; (2) 10 pazienti con neuropatie idiopatiche con predominanza sensoriale (età 55-76 anni); e (3) 2 pazienti con diabete mellito.

La gravità clinica è stata valutata mediante una modifica del punteggio totale della neuropatia.23,24

Tecnica di biopsia della pelle Le biopsie perforate sono state eseguite con un punzone circolare monouso da 3 mm (Acupunch, Acuderm, Ft Lauderdale, Fla) dopo l'iniezione locale di lidocaina al 2% con anestesia con epinefrina in una tecnica sterile. Non sono state utilizzate suture Campioni di biopsia sono stati ottenuti dai seguenti siti: la parte superiore laterale della coscia e la parte distale della gamba, circa 10 cm sopra il malleolo laterale. Dettagli delle tecniche di immunocolorazione sono forniti nelle pubblicazioni precedenti.22,25,26 Determinazione della densità lineare delle fibre nervose intraepidermiche in sezioni verticali Per ciascun campione bioptico, il numero di fibre intraepidermiche separate in almeno 3 sezioni è stato conteggiato da un singolo osservatore (E.A.S.) in cieco rispetto allo stato clinico del campione. Sono state stabilite regole di conteggio a priori per contare solo singole fibre intraepidermiche e non più rami della stessa fibra. Si noti che questo paradigma non enumera rami secondari all'interno dell'epidermide. La lunghezza totale dell'epidermide in sezioni è stata misurata mediante uno strumento computerizzato di quantificazione (BioQuant V, R & M Biometrics, Nashville, Tenn). La Figura 1 illustra il sistema di quantificazione.

Le fibre intraepidermiche separate sono state quindi identificate e contate con l'uso di 3 a 6 sezioni per ciascun punch. È stato quindi calcolato il numero medio di fibre intraepidermiche per millimetro di lunghezza dell'epidermide.27 I risultati sono stati confrontati con quelli di una tecnica stereologica.25 Le statistiche non parametriche sono state utilizzate per confrontare casi e controlli mediante un pacchetto software statistico (StatView, Abacus Concepts Inc , Berkeley, California).

Risultati

Innervazione cutanea nei controlli Nei soggetti di controllo, un gran numero di fibre nervose e terminazioni nervose specializzate sono state identificate mediante anticorpi PGP9.5 in 3 posizioni: il derma reticolare, il derma subpapillare e all'interno dell'epidermide. L'aspetto morfologico delle fibre nel sottocapitolo e nel derma sottapapillare è conforme alle precedenti descrizioni basate su argento, blu di metilene e tecniche di colorazione immunocitochimica12,28,29 e sono state descritte in precedenti pubblicazioni da Holland et al22 e McCarthy et al.26 Dati normativi: misure di densità lineare

Affidabilità del metodo Come misura della coerenza interna e dell'affidabilità, abbiamo valutato la variabilità intraosservatore e interosservatore, la variabilità all'interno delle sezioni e la variabilità tra punzoni adiacenti nello stesso sito anatomico. Intraobserver e Interobserver Affidabilità L'affidabilità intraosservativa e interosservatore è stata valutata mediante il confronto cieco dei punteggi di densità delle fibre nervose intraepidermiche per lo stesso osservatore (E.A.S.) contando due volte e tra 3 osservatori (inclusi E.A.S.). Controlli multipli sono stati contati due volte dallo stesso osservatore cieco (E.A.S.) per valutare l'accordo intraosservatore. I coefficienti di correlazione per i conteggi separati variavano da 0,74 a 0,86 (P <0,001). I coefficienti di correlazione per l'affidabilità interosservatore variavano da 0,86 a 0,94 (P <0,001), indicando un alto livello di affidabilità FIGURA2

Variazione tra le sezioni adiacenti nello stesso sito: Variabilità di intrapunch Le sezioni adiacenti dello stesso punzone sono state confrontate per valutare la variabilità dell'intreccone. I coefficienti di correlazione indicano un alto grado di associazione tra le misurazioni della densità delle sezioni adiacenti. Il coefficiente di correlazione per le sezioni della stessa serie di diapositive era 0.97 e per le serie quantitative separate di diapositive dallo stesso punch era 0.98.

Variazione tra campioni di biopsia adiacenti nello stesso sito: Variabilità intrasitativa Poiché diversi punch sono stati prelevati dallo stesso sito (coscia o parte distale della gamba), siamo stati in grado di confrontare la variazione di intrasite tra 2 punzoni processati contemporaneamente. Il coefficiente di correlazione (r = 0,87, parte distale della gamba, r = 0,86, coscia) indica un alto grado di associazione tra i 2 punzoni nello stesso sito anatomico.

Derivazione dell'intervallo di riferimento per la densità della fibra nervosa epidermica normale La TABELLA2 è un riepilogo dei dati di densità delle fibre nervose intraepidermiche per tutti i 98 controlli, stratificati per decile di età, indicando i valori medi e le distribuzioni. I valori intraepidermici delle fibre nervose nei 2 siti erano normalmente distribuiti (dati non mostrati). Il quinto percentile per la coscia era di 5,2 fibre per millimetro, per la parte distale della gamba era 3,8 per millimetro e per il rapporto tra la coscia e la parte distale della gamba era 0,72 per millimetro. Valori intraepidermici delle fibre nervose significativamente più alti sono stati osservati solo per il decile più giovane dell'età, ma nel complesso non vi è stato alcun effetto significativo dell'età per i gruppi di età più avanzata FIGURA3 La FIGURA4 dimostra la normale distribuzione della densità delle fibre nervose intraepidermiche tra i 98 controlli sani. Nel complesso, non vi è stata alcuna influenza significativa di razza, altezza, peso o sesso sulla densità delle fibre nervose intraepidermiche.

Variazione tra siti anatomici: coscia e parte distale della gamba Le densità delle fibre del nervo epidermico sulla coscia e sulla parte distale dei siti della gamba sono state confrontate per valutare se esistesse un gradiente prossimale-distale. Il coefficiente di correlazione (r = 0.56, P = .01) indica una relazione significativa tra densità di fibre nervose intraepidermiche per ciascun individuo nei 2 siti. La densità nei siti delle cosce era, in generale, superiore del 60% rispetto a quella nella parte distale della gamba, confermando un gradiente prossimale-distale nei controlli normali. Relazione tra stima stereologica e stime della densità lineare di innervazione epidermica

Quantificazione stereologica della lunghezza della fibra nervosa epidermica. Le stime stereologiche della lunghezza intraepidermica sono state determinate su un sottoinsieme selezionato casualmente dei controlli normali e il grado di associazione con le stime di densità lineare è stato determinato. Ciò ha fornito una misura della coerenza interna e della validità della costruzione per la misura della densità lineare. I dettagli completi della tecnica stereologica e dei risultati sono stati descritti da Stocks et al.25. La stereologia è stata completata in 8 individui su un totale di 16 punzoni dalla coscia e dalla parte distale della gamba e correlati alla densità intraepidermica delle fibre nervose determinata nelle stesse sezioni. La figura 5 mostra la relazione tra la lunghezza stimata della fibra intraepidermica (stereologia) e la densità lineare intraepidermica della fibra nervosa. Il coefficiente di correlazione è 0,79 (P = 0,001), suggerendo che le 2 tecniche quantitative sono internamente coerenti.

Fibre nervose cutanee nelle neuropatie Negli individui con neuropatie sensoriali sintomatiche, abbiamo notato un'evidente riduzione del numero di fibre intraepidermiche, come riportato in precedenza da Holland et al. 22 e McCarthy et al. In generale, c'era una maggiore riduzione nella parte distale del sito della gamba rispetto alla coscia. In diversi casi con gravi neuropatie, il derma conteneva fibre con aumentata varicosità e segmentazione che presumibilmente rappresentavano fibre degeneranti; l'epidermide era priva di fibre macchiate con PGP9.5. In generale, questa perdita di fibre intraepidermiche sembrava parallela al decremento del numero di fibre nel plesso papillare dermico, ma in alcuni casi era più drammatica e sproporzionata rispetto alla perdita delle fibre dermiche. Riduzioni significative (P = 0,001) nella densità delle fibre intraepidermiche sono state trovate quando i controlli sono stati confrontati con i pazienti con neuropatia sensoriale sia alla coscia che alla parte distale della gamba. Questa differenza era più marcata nella parte distale della gamba, rafforzando il concetto che i pazienti con neuropatia sensoriale presentavano neuropatie dipendenti dalla lunghezza.22 Il rapporto tra le densità della coscia e la parte distale della gamba era elevato, confermando che la fibra intraepidermica la perdita è più marcata nei siti distali.

Analisi di specificità Usando i valori di cutoff per il 10 ° o 5 ° percentile per la densità delle fibre nervose intraepidermiche, abbiamo calcolato le caratteristiche delle prestazioni con l'uso dei normali controlli e dei casi di neuropatia sensoriale. L'efficienza (percentuale correttamente classificata) variava dall'82% all'88%, a seconda del sito anatomico e del taglio utilizzato. Complessivamente, la massima specificità, efficienza e valori predittivi positivi e negativi sono stati ottenuti con l'uso del quinto taglio percentuale nella parte distale della gamba TABELLA 3

Commento

Questi studi mostrano che piccole fibre non mielinate possono essere identificate e quantificate in modo semplice all'interno dell'epidermide mediante biopsie di punch e tecniche di colorazione immunocitochimica. Nei normali controlli, siamo stati in grado di visualizzare fibre intraepidermiche profondamente penetranti, il plesso dermico delle fibre nervose, vari trasduttori sensoriali e cellule di supporto, comprese le cellule di Langerhans e le cellule di Schwann. Le scoperte morfologiche che abbiamo osservato erano identiche a quelle descritte più di trent'anni fa da Arthur e Shelley, 29 Kruger et al, 10 e Ridley.7 In questo studio, abbiamo sviluppato un range normativo per la densità delle fibre nervose intraepidermiche nella gamba e abbiamo dimostrato che la tecnica di sezionamento e colorazione è robusta, che il sistema di quantificazione è affidabile e che si correla bene con un metodo di campionamento imparziale separato, la stima stereologica della lunghezza delle fibre nervose. Infine, con l'uso di pazienti con neuropatia sensoriale e intervallo normativo di fibre nervose intraepidermiche, abbiamo esaminato le caratteristiche prestazionali della misura di densità lineare e dimostrato la sua elevata specificità e l'efficienza accettabile per distinguere i valori di fibra nervosa intraepidermica neuropatica da quelli normali. La semplicità e la ripetibilità di questa tecnica gli conferiscono rilevanza per lo studio delle neuropatie a piccole fibre. Recentemente, diversi gruppi hanno utilizzato la tecnica per identificare e enumerare le fibre nervose cutanee nella nevralgia post-erpetica30 e nella neuropatia sensoriale delle piccole fibre idiopatiche.31 Recentemente, Kennedy e al18 hanno usato questo marcatore con microscopia confocale per quantificare l'innervazione della ghiandola epidermica e del sudore e hanno dimostrato che la fibra del nervo epidermico la densità è correlata alla gravità della neuropatia periferica nei pazienti diabetici.19

Sviluppo del range normativo per l'innervazione epidermica Precedenti studi di Dyck et al.11 che esaminavano il cambiamento nei corpuscoli di Meissner in neuropatie e con l'età, e da Ridley7 che studiavano i nervi cutanei, conclusero che c'era una sostanziale variazione interindividuale e anatomica. Ciò ha ostacolato lo sviluppo della biopsia cutanea come tecnica quantitativa. La gamma di valori normali nel nostro studio è leggermente inferiore a quella registrata da Kennedy et al, 19 che ha trovato un intervallo nella parte distale del polpaccio del sito della gamba di 15 a 45 per millimetro rispetto alla nostra gamma di fino a 35 per millimetro . Erdem et al. 32 hanno anche riportato valori un po 'più alti dei nostri. Entrambi gli studi hanno utilizzato la microscopia confocale e il fissativo di Zamboni e le regole di conteggio potrebbero differire dal nostro approccio microscopico convenzionale. Quando viene utilizzata una tecnica simile, i risultati sono concordanti con i nostri. Ad esempio, utilizzando procedure di colorazione e sezionamento identiche e microscopia convenzionale, Leland Scott, MD, (comunicazione scritta, 1 dicembre 1997) ha trovato valori medi di terminazioni nervose libere per millimetro lineare di 5,0 ± 0,7 per millimetro nella parte distale della gamba e 15 ± 1,5 per millimetro alla coscia. Nonostante l'ampia variazione biologica nei dati, la distribuzione delle densità intraepidermiche delle fibre nervose nella parte distale della gamba consente la delineazione di un limite inferiore della norma in base al valore del quinto percentile per il gruppo normale. Con il valore di cutoff del quinto percentile, la percentuale correttamente classificata tra i casi di neuropatia è dell'88%. La sensibilità è del 45%; specificità, 97%; valore predittivo positivo, 92%; e valore predittivo negativo, 90%. L'elevata specificità della misura aumenta il valore predittivo positivo del test ed è quindi ideale per il suo uso previsto, vale a dire per verificare la presenza di una malattia per la quale possono esserci poche prove cliniche o elettrofisiologiche, o quando il clinico deve essere virtualmente alcune di una diagnosi, ad esempio, prima di iniziare una qualche forma di terapia.33 Tuttavia, la sensibilità relativamente bassa della misura implica che una normale densità delle fibre nervose intraepidermiche non esclude la presenza di una neuropatia sensoriale. I potenziali limiti della nostra tecnica includono la dipendenza dall'accuratezza dell'osservatore nel distinguere le fibre nervose intraepidermiche dalla colorazione falsa-positiva e dalle fibre nervose del derma. L'affidabilità intraosservatore e interosservatore, tuttavia, è stata eccellente, suggerendo che la misura ha un'elevata precisione. Nell'ampliamento degli studi, stiamo valutando i cambiamenti nei pattern di ramificazione, estendendo il singolo sistema di quantificazione per quantificare il grado di ramificazione delle fibre nervose intraepidermiche. Nelle osservazioni preliminari, sembra che l'aumento della ramificazione delle fibre nervose intraepidermiche può verificarsi prima di un cambiamento nella densità complessiva delle fibre nervose intraepidermiche (Giuseppe Lauria, MD, comunicazione scritta, 7 giugno 1997). I nostri studi sugli esseri umani hanno un'ulteriore validità dal lavoro sperimentale sugli animali di Hsieh et al34 e Li et al.35 Pertanto, modelli analoghi di perdita intraepidermica delle fibre nervose sono stati osservati nei ratti da Hsieh et al34 dopo la transezione del nervo sciatico e da Li et al35 dopo rizotomia dorsale.

Cambiamenti nelle fibre nervose dell'epidermide con l'età Non abbiamo riscontrato un decremento significativo della densità delle fibre nervose intraepidermiche con l'età, ad eccezione dei valori più elevati nei soggetti più giovani, di età compresa tra 10 e 19 anni. L'assenza di un effetto dell'invecchiamento nell'innervazione intraepidermica è in contrasto con l'intuizione, dati i ben documentati cambiamenti dell'invecchiamento nella corteccia cerebrale.36,37 L'invecchiamento produce diverse modifiche alle strutture sia neuronali che nonneuronali: levigazione della giunzione dermo-epidermica, perdita di 38 fibre a ghiandole sudorifere39 e corpuscoli Meissner, 11,40 perdita di piccole fibre mielinizzate e non mielinizzate nel nervo surale distale, 41,42 e comparsa di gonfiore assonale distrofico nei neuroni gangli dorsali delle radici.43 Anche Joko et al44 hanno dimostrato che con l'aumentare dell'età, i rami epidermici dei nervi cutanei cominciano a degenerare e sembrano essere magri e radi, rispetto a quelli dei gruppi più giovani. Hanno anche scoperto che negli individui più anziani, i fasci nervosi all'interno del derma erano più irregolari e più spessi che nel gruppo più giovane. Questo gruppo ha utilizzato la microscopia confocale a scansione laser combinata con l'analisi quantitativa utilizzando il software NIH Image (versione 1.62, Ramo dei servizi di ricerca dell'Istituto nazionale di salute mentale, National Institutes of Health, Bethesda, Md; software di pubblico dominio disponibile all'indirizzo: http: // rsb .info.nih.gov / NIH-IMAGE /) per misurare la lunghezza della fibra nervosa con immunocolorazione PGP9.5. Inoltre, studi sperimentali hanno riportato che gli animali più anziani mostrano un restringimento dei campi sensoriali correlati alla funzione delle piccole fibre, oltre a una diminuzione del germogliamento collaterale.45 Rimaniamo sorpresi da queste osservazioni e non possiamo spiegare completamente l'assenza dell'effetto dell'età sulle fibre nervose intraepidermiche. Abbiamo replicato queste osservazioni in un set separato di controlli. Questo risultato è simile alle osservazioni di altri investigatori. Ad esempio, Ridley, 7 usando la colorazione dell'argento, non ha trovato alcuna variazione nell'innervazione epidermica con l'invecchiamento, e anche Erdem et al. 32 hanno trovato poche variazioni tranne negli individui più anziani.

conclusioni Questa tecnica ha una serie di vantaggi rispetto alla biopsia nervosa convenzionale per lo studio delle neuropatie sensoriali ed è semplice, indolore e associata a una morbilità minima. La tecnica di quantificazione potrebbe essere eseguita da qualsiasi laboratorio senza attrezzature specializzate, a condizione che si presti attenzione all'addestramento dell'affidabilità e all'accuratezza del conteggio. Le piccole fibre nervose non mielinizzate sono visualizzate chiaramente con microscopia ottica con l'uso di macchie disponibili in commercio, e la misura della densità lineare è correlata bene con le tecniche stereologiche standard più labour intensive di stima della densità intraepidermica delle fibre nervose. Infine, la tecnica può essere ripetuta in serie per valutare la progressione della neuropatia e la risposta terapeutica. Accettato per la pubblicazione il 30 gennaio 1998. Questo studio è stato supportato da una sovvenzione di ricerca da Genentech Inc, South San Francisco, California, e da servizi di sanità pubblica NS14784, NS26643 e RR00722 dal Dipartimento di Neuroscienze, Istituto Nazionale di Disturbi neurologici e Stroke e Centro nazionale per le risorse di ricerca, Bethesda, Md. Siamo grati ai volontari e ai pazienti che hanno partecipato a questo studio e riconosciamo l'assistenza tecnica di Peter Mouton, PhD; Kay Carter, MA; Kate Crystal, MD; e Anna Brown.

Reprints: Justin C. McArthur, MBBS, MPH, The Johns Hopkins Hospital, 600 N Wolfe St, Meyer Bldg 6-109, Baltimore, MD 21287-7609 (e-mail: jm@jhmi.edu).

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